根据临床表现和中医理论，高血压与“眩晕”和/或“头痛”的范畴相吻合。柴归汤（CGD）用于缓解“眩晕”或“头痛”，已被证明可用于改善高血压。本研究旨在通过自发性高血压大鼠（SHR）研究CGD及其成分在高血压中的作用机制。本研究制备CGD提取物及其分级组分样品（血浆中的化合物，CP；肠中化合物，CG；血浆和肠中化合物CPG）用于动物实验。我们用CGD提取物（3 g/kg/d BW，5 g/kg/d BW，15 g/kg/d BW）和CGD组分类别（CP = 19.501  mg/kg/d，CG = 5.240  mg/kg/d，CPG = 24.741  mg/kg/d）处理4周；测量血压（BP）和肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS系统）指标；进行组织病理学以评估CGD及其成分对主动脉组织的疗效；通过超高效液相色谱结合四极飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）和化学计量学分析，应用大鼠血清样品中脂质的非靶向代谢组学，探讨代谢途径与高血压之间的关系；使用大鼠结肠内容物的16S rRNA基因测序和生物信息学分析来表征CGD及其成分对SHR大鼠肠道微生物群组成的影响。CGD及其组分混合物对SHR大鼠显示出降压作用，降低了血压并降低了SHR大鼠的主动脉壁厚度。CGD及其组分混合物可以改善SHR大鼠的RAAS，包括增加血管紧张素1-7（Ang 1-7）的百分比，降低血管紧张素II（Ang II）的百分比以及降低AngⅡ/Ang 1-7的比率。CGD及其组分混合物可以调节SHR大鼠的代谢组，主要通过降低血清中溶血磷脂酰胆碱（LPC）16:0、LPC 20:4和LPC 22:6的较高水平。此外，S24-7科的细菌与LPE 16:0、LPE 18:0、LPE18:1和LPE18:2的水平呈负相关。因此，CGD及其组分混合物对SHR大鼠具有降压作用，潜在机制可能与调节RAAS、LPC代谢和肠道中S24-7科的细菌丰度有关。

　　我们每周测量每只大鼠的收缩压（SBP）和舒张压（DBP），补充图2A和B显示了各组收缩血SBP和 DBP 的时间过程。图1A和B显示第4周的SBP和DBP。阳性药物（即SHR-shamal组）、CDG（即CGD-L、CGD-M和CGD-H组）和标志物组分（即CP、CG和CPG组）处理显示SHR大鼠第4周SBP和DBP显着降低。值得注意的是，CGD-H的降压效果与SHR-shamal相当。

　　所有组的主动脉组织病理学变化如图1所示。SHR大鼠主动脉内膜增厚，所有药物处理后显着变薄（图1C）。与WHY大鼠相比，无论SHR处理与否，所有大鼠的主动脉横截面面积都要小得多（图1D）。同样，所有SHR大鼠中主动脉横截面周长减小（图1E）。

　　XCHD：小柴胡汤；DGSYP：当归芍药散；*北沙参被用作XCHD中人参、甘草和大枣的替代品。

　　UHPLC-Q-TOF-MS用于所有实验大鼠血清样本的非靶向脂质组分析。首先，我们通过PCA分析ESI（−）和ESI（+）模式下获得的多变量数据集，得分图分别在补充图4A和B中给出。QC样品聚集在PCA评分图的中心附近，这表明脂质谱具有良好的重复性。对于ESI（−）模式的数据，可以看出SHR大鼠处于t[1]和t[2]轴的正部分，而WHY组位于t[2]轴的负部分。这表明，在ESI（−）模式下检测到的代谢产物的显着差异与SHR的病理变化有关。同时，所有处理组在t[1]轴上都表现出聚集趋势。然而，CP和CPG组的个体在t[2]轴接近WHY。对于ESI（+）模式下的数据，WHY组与SHR组有明显区别，CGD-L和CGD-M组与模型组有明显的区别，但接近WHY组，具有较好的调节作用。我们在将所有研究组分为两个小组后，进行了进一步的分析：小组1专注于CGD分析，包括WHY、SHR、SHR-sham、CGD-L、CGD-M和CGD-H组，小组2侧重于CGD成分，包括WHW、SHR-sham、CP、CG和CPG组。我们分别为小组1和小组2建立了PLS-DA模型，利用ESI（+）和ESI（−）模式下的数据，为小组1和小组2建立了PLS-DA模型，前两个主成分的得分图如图3所示。结果表明，WHY组和SHR组有显着区别，SHR组和各给药组也有明显区别。然而，每个给药样本的分布有交叉点，特别是CGD-H和SHR-sham之间存在重迭。组分组（CP、CG、CPG）和阳性药物组（SHR-sham）之间的重迭也很明显。对于PCA和PLS-DA的前两个主要成分，我们观察到WHY、SHR和处理组之间的明显区别（图3A和C），根据VIP值和非参数测试结果，我们筛选了差异产生的代谢物（p  0.05）（补充表1）。

　　使用ESI（+）和ESI（−）模式的数据绘制小组1和小组2的PLS-DA图。（A）ESI（+）模式下的小组1；（B）ESI（+）模式下的小组2；（C）ESI（−）模式下的小组1；（D）ESI（−）模式下的小组2。对于比较分析，我们使用监督正交OPLS-DA方法来比较正离子模式和负离子模式下的组。VIP阈值1，P  0.05和pcorr0.2时，WHY组和SHR组共获得28个差异变量。通过比较SHR组与CGD-L、CGD-M、CGD-H、CP、CG、CPG和SHR –sham组，我们分别获得18、25、18、24、23、24和23个差异变量。为了确定所涉及的途径，我们进一步将差异发生的代谢物引入MetaboAnalyst 5.0 (使用人类通路库进行通路分析。在潜在代谢途径图（补充图5）中，气泡越大意味着p值越小。比较参与代谢途径的化合物类型，SHR组和WHY组的差异化合物包括脂肪酸代谢、能量代谢（三羧酸循环和呼吸链反应系统）、胆汁酸代谢、磷脂代谢和血红素代谢。药物组和SHR组之间的差异代谢产物包括能量代谢（三羧酸循环和呼吸链反应系统）、胆汁酸代谢、磷脂代谢（如溶血磷脂酰胆碱、LPC）、血红素代谢和氨基酸代谢。根据上述代谢途径归属结果，结合KEGG及相关文献，我们初步推测了图4中SHR大鼠CGD的潜在代谢途径图。结果显示，SHR组LPC 16: 0、LPC 20: 4、LPC 22: 6和柠檬酸盐4种代谢物显着上调，几乎各处理组均降低。前三种属于甘油磷脂生物合成和代谢中的代谢产物。

　　越来越多的证据表明，高血压与肠道微生物群有关，肠道微生物群与代谢紊乱密切相关。为了探讨肠道微生物群在介导CGD及其成分的作用中的可能作用，我们收集结肠内容物样本，以使用16S rRNA基因V4扩增子测序分析肠道微生物群组成。在确认所有组的测序深度基本一致的前提下（补充图6A），首先，我们通过计算多样性指数（Shannon，Simpson，Chao1）来评估各组大鼠结肠内容物中微生物群的多样性（补充图6B）。结果表明，WHY组和SHR组之间以及SHR组和每个处理组之间没有显着差异，即使总体显着性p值小于0.05。然后，我们观察每个样品在门水平的菌群结构组成（补充图7A）。SHR大鼠中除拟杆菌门和厚壁菌门外的其他细菌门的总相对丰度高于WHY大鼠，药物处理组中保持了这一趋势。我们在属水平观察每个样品的菌群结构组成(补充图7B)。厚壁菌和拟杆菌的相对丰度和比例如补充图8A、B和C所示。SHR大鼠中普雷沃氏菌的相对丰度显着低于WHY大鼠，并且在每个药物处理组中这种趋势都没有恢复（补充图8D）。为了研究CGD的不同成分对肠道微生物群总体组成的影响，我们使用PCoA分析方法分析了以CGD为中心的小组1（补充图9A、B和C）和以CGD成分为中心的小组2（补充图9D、E和F）的样本数据。结果表明，WHY组与其他组显着分离，SHR组中的一些样品可以与成分处理组分离，CGD-M组与CGD的不同成分处理组之间存在显着重迭。

　　为了阐明CGD显着改变的肠道微生物群及其成分是否与检测到的参数（血压、RAAS血液成分）和缓解高血压的血液代谢有关，我们对107个肠道菌群变化簇的相对丰度、血浆脂质代谢产物与高血压相关病理指标进行Spearman相关性分析。图6中的网络显示，肠道微生物群与几乎所有与抗高血压相关的物理指标之间没有显着相关性，除了主动脉横截面面积与Faecalibacterium属显着负相关。相反，显着相关（r  0.5或r  −0.5，p  0.05）存在于肠道微生物群和代谢之间。如图6所示，普雷沃氏菌显示出与三种FA代谢（18:3、22:6和20:5）和三种LPE代谢（18:2、16:0和18:0）显着正相关。韦荣氏球菌、棒状杆菌、考拉杆菌、Anaeroplasma、未分类的f_Rikenellaceae、未分类的o_Bactoidales、未分类的f_Peptostreptococcusceae与FA、LPC和LPE代谢呈正相关。相比之下，S24-7科中未分类簇的相对丰度（在图中命名为未分类f_S24-7）与LPE 16:0、LPE 18:0、LPE18:1、LPE18:2和FA 20:5水平显着负相关。

　　肠道微生物群与检测参数和血液代谢的相关性。红色边表示正相关（r＞0.5，P  0.05)；蓝色边表示负相关（r  −0.5，P  0.05)。XCHD、当归芍药散（DSS）、CGD以及用于这些处方的植物已经使用了数千年。它们是中国和日本传统医学的重要组成部分。XCHD和DSS的结合最早由日本医学专家Yumoto Kyushin在《汉方Purist Medicine》中提出。然后，中国医学专家黄煌将该组合处方命名为CGD。除茯苓外，用于制备CGD的所有植物在包括中国、韩国和日本在内的亚洲国家被广泛用作传统药物。在这些植物中，生姜也被用作印度阿育吠陀医学的重要原料药。CGD在临床实践中用于免疫调节、保持女性身体状况和缓解症状。在这个过程中，我们发现CGD在某些情况下是治疗高血压的有效方法。此外，采用UHPLC-Q-TOF-MS数据分析策略，我们对正常大鼠CGD的化学成分组和代谢组进行全面表征，为CGD降压机制的研究提供了良好的前提。为了探讨其作用机制，为其应用和推广提供理论依据，本研究通过动物实验研究了CGD及其成分对BP、RAAS、血浆代谢组学和肠道微生物群的影响。

　　根据应用于循环的欧姆定律，血压在很大程度上取决于动脉阻力和细胞外循环体积（ECV），动脉阻力取决于血管壁的厚度和弹性。我们的结果表明，CGD及其成分可以如预期的那样降低SHR模型中的血压。与SHR大鼠相比，所有药物处理组的主动脉壁均较薄。这些数据表明，CGD及其成分在血管平滑肌中的作用可能需要进一步关注。

　　接下来，我们检测了RAAS的表达，RAAS通过调节有效循环量在BP调控中发挥关键作用。根据现有数据，RAAS的活性取决于经典的血管收缩轴和相反的血管舒张轴之间的平衡。在RAAS系统中，Ang II由Ang I直接转化而来，Ang 1–7由Ang 1间接转化而来（Ang I→Ang 1–9→Ang 1–7）。前者通过与AT1R受体相互作用增加血压，而后者通过与MAS受体结合降低血压。CGD-M、CP和CG显着降低Ang Ⅱ的百分比，而对AT1R的表达影响较弱。CP和CPG显着增加Ang 1-7的百分比和MAS受体的水平。

　　根据Sun Xuming的研究，G蛋白偶联雌激素受体（GPER）的激活增加了Ang 1-7的形成，改善了舒张功能。为了研究Ang 1-7的增加，我们用免疫组织化学实验测量了GPER的表达（补充图10）。结果表明，CGD-H组主动脉中GPER的表达明显高于CGD-L和CGD-M组。CPG组GPER的表达明显高于CP组和CG组。DSS是女性的传统处方。CGD作为XCHD和DSS的组合，在最初提出时可用于保持女性的身体状况。同时，GPER的激活具有包括NO依赖性血管舒张、增加eNOS表达和拮抗血管收缩剂激动剂引起的细胞内钙变化的作用。

　　这些数据提示，CGD，尤其是血浆中检测到的CGD成分，可能通过刺激Ang 1-7的转化和促进MAS受体的表达来调控血压。

　　此外，非靶向代谢组学和化学计量学分析用于血浆脂质代谢。结果表明，不同剂量的CGD和组分可降低SHR大鼠体内三种增加的游离脂肪酸，包括LPC 16:0、LPC 20:4和LPC 22:6。LPC是氧化损伤和促炎性低密度脂蛋白（oxLDL）的主要成分。血液中存在的LPC是不同种类的混合物，如16:0（40%）、18:2（20%）、18:1/18:00（10-15%）和20:4（10%）。目前的证据表明，LPC可以损害内皮依赖性舒张，并直接调节血管平滑肌的收缩反应。LPC具有促炎性，并且在较高浓度下具有毒性，此外，LPC通过抑制NO介导的血管舒张，在实验系统中充当血管收缩剂。LPC 16:0，名为棕榈酸（PA），是血脂中最丰富的游离饱和脂肪酸，也是主要的心脏代谢底物。PA对心肌细胞表现出正向的肌力作用，SHR大鼠中LPC 16:0的水平升高证实了这一功能。LPC20:4被命名为花生四烯酸，是细胞膜的重要成分，调节细胞膜流动性。CGD及其成分降低LPC可能是其降压作用的关键。

　　先前的研究表明，肠道微生物群在高血压的发展中起着重要作用。与健康对照组相比，高血压患者肠道微生物群的丰富性和多样性存在显着差异。许多细菌的丰度增加，如Catabacter、Robinsoleilla、沙雷氏菌、肠杆菌科、Ruminococcus torques、Parasutterella、埃希氏杆菌、志贺氏菌和Klebsiella，而Sporobacter、Roseburia hominis、Romboutsia spp.和Roseburia的丰度则有所下降。我们研究了肠道微生物群在SHR大鼠CGD调节作用中的参与。与先前文献中描述的相同，WHY组和SHR组之间厚壁菌门和拟杆菌门的比例没有显着差异。然而，与之前的报告一样，SHR大鼠和WHY大鼠的微生物群组成在PCoA中的β多样性分析中存在显着差异。与预期相反，PCoA系列图表明CGD可能无法直接改变微生物群，使其与WHY相似，从而抗高血压。然而，相关分析网络表明，9个簇（包括5个属和4个未鉴定簇）可能通过调节脂质代谢间接协调宿主血压。特别是，S24-7科中未分类簇的相对丰度与LPE16:0、LPE18:00、LPE18:1和LPE18:2水平显着负相关。S24-7科在小鼠肠道微生物群中占优势，未分类的f_S24-7平均占本研究所有组相对丰度的39.29%。Marta Toral等人发现，S24-7科的细菌丰度与高血压大鼠的SBP呈负相关。由于S24-7科的细菌直到最近才被培养，因此分类仍不明确，但在未来与CGD治疗高血压相关的研究中值得密切关注。

　　在SHR大鼠中，与野生型动物相比，观察到的差异包括厚壁菌门/拟杆菌门的比例显着增加，SCFA产生菌的丰度较低和乳酸产生菌的丰度较高。在人类中，肠道微生物群α多样性较低，革兰氏阴性菌群丰度较高，在大多数研究中，与正常血压患者相比，高血压患者的SCFA产生菌数量较少。然而，SHR和高血压患者肠道微生物群的直接比较仍不清楚。SHR和人类肠道菌群中与高血压相关的常见变化是整体结构的紊乱和SCFA产生菌丰度的降低。由于本研究还没有关注SCFA产生菌，未来我们将在这一方向开展进一步的研究。

　　由于CGD治疗厥阴型高血压疗效良好，我们期待着在临床上推广CGD作为高血压的常用治疗剂。为了实现这一目标，首先必须明确CGD抗高血压作用的机制。本文重点研究了CGD对大鼠RAAS、脂质代谢和肠道微生物群的影响，这是第一步。在未来的工作中，CGD中的活性成分可以通过消除方法来确认，并且可以通过体外实验来寻找CGD的靶点。

　　RAAS系统、代谢组学和肠道微生物群是高血压分析中最受关注的因素。我们的研究表明，口服CGD及其成分可以降低血压，并从Ang Ⅰ和血浆LPCs水平调节Ang Ⅱ和Ang Ⅰ-7的转化率。此外，以S24-7科为代表的肠道微生物群调节的脂质代谢可能是CGD对SHR大鼠健康促进作用的关键。

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